液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛尿中玉米赤霉醇、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚殘留量

[db:作者] / 2022-12-13 00:00

9.2.2.1 適用范圍

適用于牛尿中玉米赤霉醇、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定。方法檢出限：玉米赤霉醇和己烷雌酚為0.5μg/L；己烯雌酚和雙烯雌酚為1.0μg/L。

9.2.2.2 方法原理

免疫親和柱內(nèi)含有的特異性抗體選擇性地與牛尿試樣中己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚和玉米赤霉醇結(jié)合，形成抗體-抗原復(fù)合體，用水淋洗柱除去雜質(zhì)，用洗脫劑洗脫吸附在柱上的目標(biāo)物，收集洗脫液。試液用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，保留時(shí)間和離子豐度比定性，內(nèi)標(biāo)法定量。

9.2.2.3 試劑和材料

甲醇、乙醇、乙腈：色譜純。

淋洗液：將Randox試劑盒中提供的淋洗原液用去離子水按1：20稀釋。

洗脫液：乙醇+水(70+30，v/v)。量取70mL乙醇與30mL去離子水混合。

儲(chǔ)備液：將Randox試劑盒中提供的儲(chǔ)備原液用去離子水按1：5稀釋。

激素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：玉米赤霉醇(包括a-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇，各50%)純度≥97%；己烯雌酚，純度≥99%；己烷雌酚，純度≥98%；雙烯雌酚，純度≥98%。

激素標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別準(zhǔn)確稱(chēng)取適量的玉米赤霉醇、己烯雌酚、已烷雌酚和雙烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇配制成1.0mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。再根據(jù)需要以甲醇配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液作為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，保存于4℃冰箱中，可使用3個(gè)月。

內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：玉米赤霉醇-4氘代(包括Q-玉米赤霉醇-4氘代和β-玉米赤霉醇-4氘代，各50%)，純度≥99%；己烯雌酚-8氘代，純度≥98%。

內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取適量玉米赤霉醇-4氘代和己烯雌酚-8氘代標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇分別配制成1.0mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。再以甲醇稀釋成適用濃度的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，保存于4℃冰箱中，可使用3個(gè)月。

免疫親和層析柱：Randox(英國(guó))或相當(dāng)者；玉米赤霉醇免疫親和層析柱：親和柱的最大容量為100ng玉米赤霉醇；二苯乙烯免疫親和層析柱：親和柱的最大容量為50ng己烯雌酚，50ng己烷雌酚，50ng雙烯雌酚。

9.2.2.4 儀器和設(shè)備

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：配有大氣壓化學(xué)電離源；離心機(jī)：轉(zhuǎn)速大于3000r/min；氮?dú)鉂饪s儀；渦旋振蕩器。

9.2.2.5 樣品前處理

(1) 試樣制備

取有代表性樣品，制成實(shí)驗(yàn)室樣品。試樣分為兩份，置于樣品瓶中，密封，并做上標(biāo)記。將試樣置于2~8℃下保存。

(2) 樣品稱(chēng)取

取5個(gè)陰性牛尿樣品，每個(gè)10mL，于50mL離心管中，3000r/min離心15min。向5支10mL試管中，分別加入不同量混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使玉米赤霉醇和己烷雌酚的濃度為1.25ng/mL、2.5ng/mL、5.0ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL；己烯雌酚和雙烯雌酚的濃度為2.5ng/mL、5.0ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL。再分別加入適量混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使其濃度均為10ng/mL。加入3mL離心后牛尿的上清液，渦旋30s溶解，待凈化。

(3) 凈化

用15mL淋洗液分兩次預(yù)洗免疫親和層析柱，流速不大于3mL/min。上樣，自然流速。用5mL淋洗液以不大于2mL/min的速度淋洗，等體積重復(fù)淋洗一次，再用5mL去離子水以不大于2mL/min的速度淋洗。用4mL洗脫液洗脫，流速不大于2mL/min，收集洗脫液。將洗脫液在氮?dú)鉂饪s儀上于40℃水浴中吹干，加入1mL流動(dòng)相，渦旋30s溶解。溶液經(jīng)濾膜過(guò)濾后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

(4) 試樣溶液的制備

取經(jīng)3000r/min離心15min后待測(cè)樣品3mL于50mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使其含量均為2.0μg/kg。按上述步驟操作。

(5) 空白基質(zhì)溶液的制備.

取經(jīng)3000r/min離心15min后陰性樣品3mL于50mL離心管中，按上述步驟操作。

9.2.2.6 測(cè)定

(1) 液相色譜條件

色譜柱：ZORBAXEclipseSB-C8，3.5μm，150mm×4.6mm，或相當(dāng)者；柱溫；25℃；流動(dòng)相：乙腈-水(70+30，v/v)；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：50μL。

(2)質(zhì)譜條件

離子化方式：大氣壓化學(xué)電離；掃描方式：負(fù)離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；離子源溫度：325℃；霧化氣壓力：15psi；氣簾氣壓力：10psi；輔助氣1壓力：35psi；噴霧器電流：-5μA；電噴霧電壓：-4500V；定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、碰撞能量和去簇電壓見(jiàn)表9-4。

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